Viva Origino Vol.40 No.4
D-AMINO ACID IN FOOD: OCCURRENCE, PRODUCTION MECHANISM, AND FUNCTION


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Tadao Oikawa
Department of Life Science & Technology, Faculty of Chemistry, Materials and Bioengineering, Kansai University
3-3-35, Yamate-Cho, Suita-Shi, Osaka-Fu, 564-8680, Japan
oikawa@kansai-u.ac.jp
Fax: 06-6388-8609

Abstract
     In general, enzymes are essential molecules for maintaining of life and are composed of various amino acids. The amino acids synthesized chemically contain both D- and L-amino acids, but enzymes contain exclusively L-amino acids in their peptide chains. This fact leed to the origin of life, and many theories were mentioned but anyway both D- and L- amino acids co-existed at the beginning of the forming of the earth. Accordingly, D-amino acids exist more than 50 milion years ago in nature, but the existence of D-amino acids have been ignored until the analytical methods for D-amino acids develope. Recently, much attention has been payed for the relationship between D-amino acid in food and their function in life.
      In this work, I will describe D-amino acid in food, especially in sake, and discuss about occurrence, production mechanism, and function of D-amino acid in sake. I analyzed D- and L-amino acids contents of 141 kind of sake by combination of 3 diffenrent chiral derivertization methods for high-performance liquid chromatography. I analyzed the relationship betwee D- or L-amino acid content and taste of sake using principle component analysis. I found that D-amino acid content of sake increased when it was produced with Kimoto. The lactic acid bacteria contained Kimoto produced extracellularly D-alanine, D-aspartic acid, and D-glutamic acid. Principle component analysis revealed that D-alanine, D-aspartic acid, and D-glutamic acid in sake increased umami and total evaluation of sake. This new function of D-amino acid in food will make various functional foods and contribute to human health in daily life.

(Keywords)

D-Amino acid, Functional food, Sake, Amino acid racemase, Kimoto, Lactic acid bacteria, Principle component analysis



食品中のD-アミノ酸:存在、生成機構、機能
老川 典夫
関西大学 化学生命工学部 生命・生物工学科
〒564-8680 大阪府吹田市山手町3-3-35
FAX:06-6388-8609
E-mail:oikawa@kansai-u.ac.jp



1.緒論

 生命の根幹を担う酵素は、一般にタンパク質から成り、そのタンパク質はアミノ酸で構成されている。アミノ酸は化学合成するとL体とD体が等量生成するが、酵素タンパク質を構成するアミノ酸はすべてL体である。生命誕生の起源にもつながるこの謎には、多くの学説が唱えられているが、いずれにしても地球創成期から宇宙にはL体とD体のアミノ酸が存在していたことは明らかである[1]。したがって、人類が誕生したとされる約500万年以上前から自然界にはD-アミノ酸が存在していたが、近年分析技術が進展するまでその存在は見過ごされてきた。特にヒトが摂取する食品中のD-アミノ酸は、生命現象との関連性から注目されている[2,3,4,5,6,7]。  本論文では、食品中のD-アミノ酸について、日本の伝統的発酵食品である日本酒を例にその存在、生成機構、機能について、著者の最近の研究成果をもとに論じる。まず51社の酒造会社の141種類の日本酒中に含まれるD-及L-アミノ酸を定量し、各製品のD-及L-アミノ酸濃度、生産地、日本酒度、アミノ酸度、原料米の精米歩合、アルコール度数、原料米の品種、醸造方法を検討する。これらのデータに基づき、日本酒中に含まれるD-及びL-アミノ酸の種類を特定するとともに、それぞれの含有濃度範囲を推定する。また、D-アミノ酸濃度の高い日本酒のD-アミノ酸濃度と生産地、日本酒度、アミノ酸度、原料米の精米歩合、アルコール度数、原料米の品種、醸造方法との間に関連性を見出す。また51社の酒造会社の141種類の開封直後の官能評価試験の結果を主成分分析で解析し、日本酒中のD-アミノ酸が日本酒の味や総合評価に及ぼす影響を解明する。さらに、生酛、速醸酛、乳酸菌添加生酛(簡易生酛)の3種類の日本酒醸造方法のさまざまな工程で採取した試料中に含まれるD-及びL-アミノ酸の定量分析や官能評価の低い日本酒へのD-アミノ酸添加と官能評価試験を実施するとともに主成分分析で日本酒中のD-アミノ酸濃度と味の評価を解析し、醸造方法や醸造工程が日本酒中のD-アミノ酸含有量に及ぼす影響や日本酒中のD-アミノ酸が日本酒の味に及ぼす影響を解析し、D-アミノ酸濃度の高い、味や総合評価が優れた日本酒を製造する方法を、製品情報と製造方法及び工程の両面から解明することを目的とする。

2. 試料と分析

2.1 試料
  分析には、51都道府県の141の日本酒をランダムに購入し使用した。これらの日本酒の種別とその数は、大吟醸(9製品)、純米大吟醸(14製品)、吟醸(9製品)、純米吟醸(42製品)、特別本醸造(2製品)、特別純米酒(9製品)、本醸造(15製品)純米酒(35製品)、普通酒(6製品)であった。

2.2 分析方法
  日本酒中のD-及びL-アミノ酸の定量には、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた。また、D-及びL-アミノ酸の蛍光キラル誘導体化には、①OPA/NACプレラベル法(o-フタルアルデヒド/N-アセチル-L-システイン)[8]、②FLEC/AMAMプレラベル法((+)-1-(9-フルオレニル)エチルクロロホルメート/1-アミノアダマンタン)[9]、③OPA/NACポストラベル法[10]を併用することにより、システイン(システインはDL-システインとして定量)とグリシン(光学異性体がない)を除く全ての日本酒中のD-及びL-アミノ酸を定量した。D-及びL-アミノ酸は検量線法で定量した。①~③の蛍光キラル誘導体化法について、それぞれ検量線を作成することにより、蛍光キラル誘導体化法の違いによる蛍光強度の違いを除外した。①、②、③の蛍光キラル誘導体化法でのD-及びL-アミノ酸の測定可能な範囲は、それぞれ6 nM~20μM、10 nM~20μM、1.5 μMであった。また、D-アミノ酸の相対含有割合(%D)は、
%D = 100×AD/(AD+AL)、
AD:D-アミノ酸のピーク面積
AL:L-アミノ酸のピーク面積
で算出した。

3. 方法

3.1 日本酒中のD-及びL-アミノ酸の定量的解析
   51社の酒造会社の141種類のすべての製品について、D-及びL-アミノ酸の分析と定量解析を行った。サンプルのアミノ酸分析は、プレラベル型OPA-NACキラル誘導体化法でアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、トリプトファン、バリン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンのD-及びL-体とグリシンを定量し、また本法では分離・定量が困難なアミノ酸のうち、システインは、DL体としてポストラベル型OPA-NACキラル誘導体化法で、さらに、メチオニン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン、リシン、ヒスチジン、プロリンについては、ADAME法を用いてそれぞれのアミノ酸のD-及びL-体を分離定量した。

3.2 日本酒中のD-及びL-アミノ酸の種類・含有量の系統的解析と官能評価分析
  51社の酒造会社の141種類のすべての日本酒中に含まれるD-及びL-アミノ酸の種類・含有量の系統的解析と官能評価分析を行った。官能評価試験は、大阪国税局清酒鑑評会品質評価員1名に依頼し実施した。官能評価は、色沢(1. 濁り(あり・なし)、2. 色(無色・黄色・茶褐色)、香り(1. 高低(高い・普通・低い)、2. 酸臭(強い・弱い・なし)、3. 炭臭(強い・弱い・なし)、4. 甘臭(強い・弱い・なし)、5. 特性(新酒臭・吟醸香・熟成香・個性的))、味(1. 濃淡(旨味ある・濃醇・普通・淡麗)、2. 苦み(苦みうく・強い・普通・弱い)、3. 酸味(酸うく・強い・普通・弱い)、4. 旨味(だれる・強い・普通・弱い)、5. 甘味(だれる・甘うく・普通・弱い)、6. その他)、総合(1. 調和(良好・普通・不調和)、2. 熟度(熟成・普通・若い))について実施した。また、官能評価試験の結果は数値化し、主成分分析で解析した。さらに、開封後一定期間保存中のD-アミノ酸の増加に関与する微生物を特定するため、開封後保存中にD-アミノ酸の増加が確認された12銘柄について、開封直後の日本酒中に含まれるD-及びL-アミノ酸の分析、定量解析と日本酒中に含まれる微生物の単離と同定を実施した。

3.3 日本酒へのDL-アラニン及びL-アラニン添加と官能評価試験
    D-アミノ酸含有量が低くかつ官能評価試験の低い日本酒3製品に、DL-アラニン及びL-アラニンを終濃度がそれぞれ0, 0.010, 0.020, 0.050, 0.100, 0.200, 0.500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000 mM 及び0, 0.005, 0.010, 0.025, 0.050, 0.100, 0.250, 0.5000, 1.000, 2.500, 5.000 mMになるように添加し、官能評価試験を実施するとともに、D-及びL-アミノ酸濃度を定量した。また、主成分分析を行い、DL-アラニン濃度と味の評価を解析した。

3.4 生酛系日本酒醸造工程で採取された試料中のD-及びL-アミノ酸の分析と定量解析
    酒造会社A社から提供された生酛系日本酒醸造工程で採取された試料中のD-及びL-アミノ酸の分析と定量解析を行った。A社は、D-アミノ酸濃度が高い仕込み方であることが明らかとなった生酛をその製造方法に用いている。A社の試料には、酒母、酒母もろみ、米麹(酛麹及び掛け麹)、原料米(兵系酒18号、五百万石、山田錦、日本晴)を用いた。仕込み方法は、生酛、簡易生酛、速醸酛の3種の異なる方法の試料を用いた。生酛、乳酸菌添加生酛(簡易生酛)、速醸酛の仕込み2日目、膨れ前、戻し、上槽の各工程でサンプリングした液体画分(39サンプル)と原料米(4サンプル)、米麹(2サンプル)の合計39サンプル中のD-及びL-アミノ酸含有量を定量した。玄米または米麹はミルで粉砕後、ふるいにかけ、米粉を緩衝液(pH 8)に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕後、遠心分離し、除タンパク処理後、中和し、遠心後の上清をフィルターろ過したものを分析試料とした。また液体画分は遠心分離し、除タンパク処理後、中和し、遠心後の上清をフィルターろ過したものを分析試料とした。

3.5 D-アミノ酸高生産生酛由来乳酸菌の選抜と試験醸造酒の作成
    生酛由来乳酸菌Lactobacillus sakei 12株と生酛由来乳酸菌 Leuconostoc mesenteroides 16株は生酛系日本酒醸造会社A社から提供されたものを用いた。まずL. sakei 12株とL. mesenteroides 16株を、MRS培地(Glucose 18.5 g, Peptone 10 g, Meat extract 8 g, Yeast extract 4 g, Sodium acetate 3 g, K2HPO4 2 g, Ammonium citrate 2 g, Tween 80 1 g, MgSO4・7H2O 0.2 g, MnSO4・4H2O 0.05 g, Deionized water 1 liter, pH 6.5)で、それぞれ30℃で静置培養後、遠心分離を行いその上清を回収した。得られた培養液の上清にトリクロ酢酸を添加し除タンパク後、水酸化ナトリウムで中和し生じた沈殿を微量遠心機で沈殿除去後、その上清をアミノ酸分析用サンプルとした。得られたD-及びL-アミノ酸の分析結果に基づき、L. sakei 12株とL. mesenteroides 16株からD-アミノ酸高生産株を選抜した。選抜したL. sakeiL. mesenteroidesを、米の酵素分解物を炭素源とする培地で、それぞれ30℃で静置培養後、遠心分離を行いその上清を回収した。得られた培養液の上清にトリクロロ酢酸を添加し除タンパク後、水酸化ナトリウムで中和し生じた沈殿を微量遠心機で沈殿除去後、その上清をアミノ酸分析用サンプルとした。さらに米の酵素分解物を炭素源とする培地(米培地)でD-アミノ酸生産量の最も高いL. sakei及びL. mesenteroidesを選抜し、D-アミノ酸強化日本酒生産のための試験醸造を行った。試験醸造は①乳酸菌標準菌株を用いる乳酸菌添加生酛、②現在製造に用いられている乳酸菌添加生酛、③D-アミノ酸生産量の最も高い乳酸菌を用いる乳酸菌添加生酛、④速醸酛の4仕込みで行った。また得られら試験醸造酒のD-及びL-アミノ酸の定量と官能評価試験を実施した。

3.6 生酛由来乳酸菌のD-アミノ酸代謝関連酵素活性の探索とD-アミノ酸代謝関連酵素遺伝子のクローニング
   生酛由来乳酸桿菌Lactobacillus sakei NBRC 15893のアラニンラセマーゼホモログ遺伝子(alr)、グルタミン酸ラセマーゼホモログ遺伝子(murI)、アスパラギン酸ラセマーゼホモログ遺伝子(aspr)と生酛由来乳酸球菌Leuconostoc mesenteroides subsp. sake NRRC 102480の3つのアラニンラセマーゼホモログ遺伝子(alr1、alr2、alr3)と1つのグルタミン酸ラセマーゼホモログ遺伝子(murI)を、それぞれ発現ベクターに挿入し、大腸菌に形質転換した7つのクローン株を培養し、菌体を集菌した。これらの遺伝子産物は、精製が容易なHis-タグ融合タンパク質として発現するよう発現ベクターを選択した。それぞれの菌体を、超音波破砕機により破砕後、遠心分離を行い、その上清を無細胞抽出液とした。得られたそれぞれの無細胞抽出液から、7種の遺伝子産物を精製した。精製には、GEヘルスケア・ジャパン(株)社製 AKTA purifier UPC 10ベースシステムを用いた。カラムには、His-タグ融合タンパク質と強い親和性を示すNi-NTAアフィニティーカラムを用いた。得られた7つの精製酵素標品を用い、7つの遺伝子産物の酵素科学的特性(分子量、サブユニット構成、基質特異性、補酵素特異性、最適温度、最適pH、熱安定性、pH安定性、酵素反応速度論的パラメーター等)を解明した。

4. 結果と討論

4.1 日本酒中のD-及びL-アミノ酸の定量的解析
   本研究により、日本酒中のD-アミノ酸の含有量は、製品によって大きく異なることが明らかとなった(Table 1, Table 2, Table3)。51社の酒造会社の141種類の日本酒に含まれている各D-アミノ酸の割合は、D-アスパラギン酸(97.8%)、D-アラニン(96.4%)、D-アルギニン(82.9%)、D-プロリン(71.4%)、D-グルタミン酸(66.4%)、D-バリン(65.7%)、D-リシン(60.7%)、D-フェニルアラニン(59.9%)、D-イソロイシン(58.4%)、D-ヒスチジン(52.1%)、D-アスパラギン(51.4%)、D-チロシン(51.1%)、D-グルタミン(33.8%)、D-ロイシン(4.4%)、D-セリン(2.5%)、D-スレオニン(0%) 、D-メチオニン(0%)、D-トリプトファン(0%)であることが明らかとなった。一方、51社の酒造会社の141種類の日本酒に含まれている各L-アミノ酸の割合は、L-アスパラギン酸(100%)、L-トレオニン(100%)、L-アラニン(100%)、L-メチオニン(100%)、L-アルギニン(100%)、L-ヒスチジン(100%)、L-アスパラギン(100%)、L-セリン(99.3%)、L-バリン(99.3%)、L-フェニルアラニン(99.3%)、L-プロリン(99.2%)、L-グルタミン(99.2%)、L-イソロイシン(97.8%)、L-リシン(97.1%)、L-ロイシン(88.3%)、L-チロシン(75.9%)、L-トリプトファン(0%)であることが明らかとなった。さらに、DL-システインとグリシンの含有割合は、それぞれ75.6%、100%であることが明らかとなった。得られたD-及びL-アミノ酸濃度のデータに基づき、アミノ酸濃度が高い日本酒とD-アミノ酸濃度が低い日本酒について、それぞれ種別、日本酒度、酸度、アミノ酸度、精米歩合、アルコール度数、原料米のデータを比較検討した。その結果、日本酒中のD-アミノ酸含有量と種別、日本酒度、酸度、アミノ酸度、原料米の精米歩合、アルコール度数、原料米の品種とは、明確な関連性はないことが明らかとなった。しかし、生酛、山廃、赤色酵母、海洋深層水、長期熟成で仕込まれている日本酒のD-アミノ酸濃度は、高い傾向が確認された(Table 4)。









4.2 日本酒中のD-及びL-アミノ酸の種類・含有量の系統的解析と官能評価分析
  51社の酒造会社の141種類の開封直後の官能評価試験の結果を主成分分析で解析したところ、第1主成分に濃淡と調和が第2主成分に甘味と酸味・苦味が寄与する評価結果が得られ、今回解析した日本酒は様々な評価結果をもつことが明らかとなった。これら主成分得点とD-アミノ酸との関係を検討した結果、日本酒中のD-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸は、低濃度では、味や総合評価に影響を及ぼさないが、高濃度にこれらのD-アミノ酸を含む日本酒は、味や総合評価が高いことが明らかとなった(Figure 1, Figure 2)。一方、日本酒中のL-アラニン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸には、D-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸のような日本酒の味や総合評価を高める効果がないことが明らかとなった。



Figure 1. The effects of the D-Ala and D-Asp concentrations in 141 sakes on the PC1 score.



Figure 2. The effects of the D-Glu concentration in 141 sakes on the PC1 score.

4.3 日本酒へのDL-アラニン及びL-アラニン添加と官能評価試験
   本研究により、日本酒にDL-アラニンを添加すると、L-アラニンよりも低濃度で官能評価試験の旨味が、増強されることが明らかとなった(Table 5)。また、日本酒にL-アラニンを添加すると、官能評価試験の苦みが増強されることが明らかとなった(Table 5)。このL-アラニンによるに苦味の増強は、D-アラニンが共存すると、減少することが明らかとなった(Table 5)。また得られたデータを主成分分析で解析したところ、DL-アラニンは、L-アラニンより低濃度で第1主成分得点である濃淡を増加させることが明らかとなった(Table 5)。



4.4 生酛系日本酒醸造工程で採取された試料中のD-及びL-アミノ酸の分析と定量解析
   本研究により、生酛、乳酸菌添加生酛は、日本酒中のD-アミノ酸濃度を増加させるのに有効な醸造方法であることが明らかとなった。まず各種原料米中のD-アミノ酸濃度を測定したところ、兵系酒18号にはD-アスパラギン酸、D-アラニン、D-バリン、D-グルタミン酸が、五百万石にはD-アスパラギン酸、D-アラニン、D-バリン、D-グルタミン酸が、山田錦にはD-アスパラギン酸、D-アラニン、D-セリン、D-バリン、D-グルタミン酸が、日本晴にはD-アスパラギン酸、D-アラニン、D-セリン、D-バリン、D-グルタミン酸がそれぞれ含まれていることが明らかとなった。D-セリンは山田錦と日本晴にのみ検出された。しかし、原料米中のD-アミノ酸の濃度は全て1 μM以下であり、日本酒中のD-アミノ酸にはほとんど影響を及ぼさないことが明らかとなった。仕込み後2日目の試料中には、簡易生酛ではD-アスパラギン酸、D-アラニン、D-バリン、D-イソロイシン、D-フェニルアラニンが、速醸酛ではD-アスパラギン酸、D-バリンがそれぞれ存在することが明らかとなった(Figure 3)。D-アラニン、D-イソロイシン、D-フェニルアラニンは簡易生酛の試料中には検出されたが速醸酛の試料中には検出されなかったことから、簡易生酛に存在する乳酸菌によってこれらのD-アミノ酸が生産されることが明らかとなった。膨れ前の試料中には、生酛ではD-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-アラニン、D-セリン、D-バリンが、簡易生酛ではD-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-アラニン、D-バリンがそれぞれ存在することが明らかとなった(Figure 3)。D-セリンは生酛の試料中には検出されたが簡易生酛の試料中には検出されなかったことから、生酛に存在する微生物によってD-セリンが生産されることが明らかとなった。戻しの試料中には、生酛ではD-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-アラニン、D-セリン、D-バリンが、簡易生酛ではD-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-アラニン、D-バリン、D-ロイシンが、速醸酛ではD-グルタミン酸、D-アラニン、D-バリン、D-ロイシンがそれぞれ存在することが明らかとなった(Figure 3)。D-アスパラギン酸は生酛、簡易生酛の試料中には検出されたが速醸酛の試料中には検出されなかったことから、生酛、簡易生酛の試料中に存在する乳酸菌によってD-アスパラギン酸が生産されることが明らかとなった。またD-セリンは生酛の試料中には検出されたが簡易生酛、速醸酛の試料中には検出されなかったことから、生酛に存在する微生物によってD-セリンが生産されることが明らかとなった。上槽の試料中には、生酛ではD-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-アラニン、D-セリン、D-バリンが、簡易生酛ではD-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-アラニン、D-バリンが、速醸酛ではD-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-アラニン、D-バリンがそれぞれ存在することが明らかとなった(Figure 3)。試料中のD-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-アラニンの濃度は、いずれも生酛が最も高いことが明らかとなった。以上の結果から、生酛、簡易生酛、速醸酛の醸造工程中にはD-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸が存在し、D-アラニン、D-アスパラ ギン酸、D-グルタミン酸は膨れ前から戻しにかけて増加することが明らかとなった(Figure 3)。また、これらのD-アミノ酸濃度は、醸造方法によって大きく異なり、特に生酛、簡易生酛の醸造工程中の試料にD-アミノ酸が多量に含まれていることが明らかとなった。これらの結果から、日本酒中のD-アラニン、 D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸は、生酛、簡易生酛の醸造に関与する乳酸菌によって生産されることが明らかとなった。



Figure 3. Comparison of D-amino acid concentrations in various brewing processes of Kimoto, Lactic acid bacteria added kimoto, and Sokujomoto.

4.5 D-アミノ酸高生産生酛由来乳酸菌の選抜と試験醸造酒の作成
   MRS培地で培養した結果、L. sakei, L. mesenteroidesいずれの乳酸菌でもD-アミノ酸の生産総量やその構成比に違いがあることが明らかとなった。L. sakei 117株が12株のL. sakei中MRS培地を用いた場合には最もD-アミノ酸生産能が高いことが明らかとなった。またL. mesenteroides 103株が16株のL. mesenteroides中MRS培地を用いた場合には最もD-アミノ酸生産能が高いことが明らかとなった。さらにL. sakei 117株とL. mesenteroides 103株の米の酵素分解物を炭素源とする培地でのD-アミノ酸能を検討したところ、L. sakei 117株及びL. mesenteroides 103株いずれもD-アミノ酸生産が確認されたが、MRS培地でのD-アミノ酸生産量とは違いがあることが明らかとなった。そこでD-アミノ酸生産能が高いLactobacillus sakei 6株とLeuconostoc mesenteroides 6株の米の酵素分解物を炭素源とする培地でのD-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸の生産能を検討したところ、L. sakei 145株が6株のL. sakei中米の酵素分解物を炭素源とする培地を用いた場合には最もD-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸生産 能が高いことが明らかとなった。またL. mesenteroides 151株が6株のL. mesenteroides中米の酵素分解物を炭素源とする培地を用いた場合には最もD-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸生産能が高いことが明らかとなった(Table 6)。そこでL. sakei 145株とL. mesenteroides 151株を用い、乳酸菌添加生酛で試験醸造を行った。対照3仕込みを含め01:L. sakei 基準株とL. mesenteroides 基準株を用いたもの; 02:L. sakei 117株とL. mesenteroides 103株を用いたもの;03:L. sakei 145株とL. mesenteroides 151株を用いたもの;04:速醸酛の4仕込みで行った。得られた01~04の4種の試験醸造酒中のD-及びL-アミノ酸含有量を定量したところ、乳酸菌添加生酛01~03中で、D-アミノ酸高生産乳酸菌L. sakei 145株とL. mesenteroides 151株を用いた試験醸造酒03のD-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-バリン、D-ロイシン濃度が最大となった(Table 7)。また試験醸造酒01~04の官能評価試験を行い、主成分分析で解析したところ、試験醸造酒03の濃淡を示す第1主成分得点が最も高く、前年度までに日本酒の味に寄与することを特定したD-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸の強化が味に影響していることが明らかとなった。

4.6 生酛由来乳酸菌のD-アミノ酸代謝関連酵素活性の探索とD-アミノ酸代謝関連酵素遺伝子のクローニング
   生酛由来の乳酸桿菌 Lactobacillus sakei NBRC 15893には、アラニンラセマーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、アスパラギン酸ラセマーゼをコードするalrmurIracDの3遺伝子が、また生酛由来の乳酸球菌 Leuconostoc mesenteroides subsp.sake NRRC 102480には、3つのアラニンラセマーゼをコードするalr1、alr2、alr3とグルタミン酸ラセマーゼをコードするmurIが存在することが明らかとなった。L. sakei NBRC 1589のアラニンラセマーゼは、Corynebacterium glutamicum [11]、Escherichia coli [12]のアラニンラセマーゼとそれぞれ33%、29%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は91 kDaで、ホモダイマー構造を有することが明らかとなった。ヒドロキシルアミンによる阻害や420 nm付近に吸収極大を有することから、本酵素は、ピリドキサール5’-リン酸(PLP)を補酵素とすることが明らかとなった。最適温度は35℃、最適pHは10.5であることが明らかとなった。本酵素は、アラニンだけでなくセリンも基質とすることが明らかとなった。本酵素のKeqは約1となり、アミノ酸ラセマーゼであることが明らかとなった。L. sakei NBRC 1589のアスパラギン酸ラセマーゼは、Lactobacillus brevis [13]、Lactobacillus casei [13]、Bifidobacterium bifidum [14]、のアスパラギン酸ラセマーゼとそれぞれ59%、53%、42%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は52 kDaで、ホモダイマー構造を有することが明らかとなった。最適温度は45℃、最適pHは6.5であることが明らかとなった。本酵素は、アスパラギン酸に高い特異性を有することが明らかとなった。本酵素のKeqは約1となり、アミノ酸ラセマーゼであることが明らかとなった。L. sakei NBRC 1589のグルタミン酸ラセマーゼは、Pediococcus pentosaceus [15]、Escherichia coli [16]のグルタミン酸ラセマーゼとそれぞれ54%、51%、49%、50%、29%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は35 kDaで、モノマー構造を有することが明らかとなった。最適温度は37℃、最適pHは10であることが明らかとなった。本酵素は、グルタミン酸に高い特異性を有することが明らかとなった。5,5´-ジチオビスなどのSH阻害剤による阻害から、本酵素はSH酵素であることが明らかとなった。本酵素のKeqは約1となり、アミノ酸ラセマーゼであることが明らかとなった。またLeuconostoc mesenteroides subsp.sake NRRC 102480には、3つのアラニンラセマーゼホモログ遺伝子(alr1、alr2、alr3)と1つのグルタミン酸ラセマーゼホモログ遺伝子(murI)が存在することが明らかとなった。これらの4遺伝子を、大腸菌で発現し各々の遺伝子産物を精製する方法を確立できた。
   またL. mesenteroides subsp.sake NRRC 102480のalr1はアラニンラセマーゼをコードしていることが明らかとなった。Acetobacter aceti [17]、Corynebacterium glutamicum [11]、Geobacillus stearothemophilus [18]、Helicobacter pyrori [19]のアラニンラセマーゼとそれぞれ33.3%、29.0%, 38.0%、26.7%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は82 kDaで、ホモダイマー構造を有することが明らかとなった。ヒドロキシルアミンによる阻害や420 nm付近に吸収極大を有することから、本酵素は、ピリドキサール5’-リン酸(PLP)を補酵素とすることが明らかとなった。最適温度は15℃、最適pHは6.5であることが明らかとなった。本酵素は、アラニンだけでなくセリンも基質とすることが明らかとなった。本酵素のKeqは約1となり、アミノ酸ラセマーゼであることが明らかとなった。L. mesenteroides subsp.sake NRRC 102480のalr2はリシンラセマーゼをコードしていることが明らかとなった。Acetobacter aceti[17]、Corynebacterium glutamicum [11]、Geobacillus stearothemophilus [18]、Helicobacter pyrori [19]、Pseudomonas putida [20]のアラニンラセマーゼとそれぞれ23.0%、29.8%、39.7%、30.2%、24.9%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は89 kDaで、ホモダイマー構造を有することが明らかとなった。ヒドロキシルアミンによる阻害や420 nm付近に吸収極大を有することから、本酵素は、ピリドキサール5’-リン酸(PLP)を補酵素とすることが明らかとなった。最適温度は25℃、最適pHは8.0であることが明らかとなった。本酵素は、リシンの他、オルニチンやアルギニンにも作用することが明らかとなった。本酵素のKeqは約1となり、アミノ酸ラセマーゼであることが明らかとなった。L. mesenteroides subsp.sake NRRC 102480のalr3はヒスチジンラセマーゼをコードしていることが明らかとなった。Acetobacter aceti[17]、Corynebacterium glutamicum [11]、Geobacillus stearothemophilus [18]、Helicobacter pyrori [19]、Pseudomonas putida [20]のアラニンラセマーゼとそれぞれ31.4%、29.8%、34.6%、25.1%、24.6%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は89 kDaで、ホモダイマー構造を有することが明らかとなった。ヒドロキシルアミンによる阻害や420 nm付近に吸収極大を有することから、本酵素は、ピリドキサール5’-リン酸(PLP)を補酵素とすることが明らかとなった。最適温度は50℃、最適pHは9.5であることが明らかとなった。本酵素は、ヒスチジンに高い特異性をもつことが明らかとなった。本酵素のKeqは約1となり、アミノ酸ラセマーゼであることが明らかとなった。ヒスチジンラセマーゼについてはこれまで全く報告がなく本酵素が最初の例であり新規酵素であることが明らかとなった。L. mesenteroides subsp.sake NRRC 102480のmurIはグルタミン酸ラセマーゼをコードしていることが明らかとなった。Bacillus subtilis [21]、Mycobacterium tuberculosis[22]のグルタミン酸ラセマーゼとそれぞれ42.6%、36.9%%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は42 kDaで、モノマー構造を有することが明らかとなった。本酵素は補酵素を要求しないことが明らかとなった。最適温度は25℃、最適pHは7.5であることが明らかとなった。本酵素は、グルタミン酸に高い特異性をもつことが明らかとなった。本酵素のKeqは約1となり、アミノ酸ラセマーゼであることが明らかとなった。以上の結果、生酛由来の乳酸桿菌 Lactobacillus sakei NBRC 15893のアラニンラセマーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ、アスパラギン酸ラセマーゼをコードするalrmurIracDの3遺伝子産物と生酛由来の乳酸球菌 Leuconostoc mesenteroides subsp.sake NRRC 102480の3つのアラニンラセマーゼをコードするalr1、alr2、alr3とグルタミン酸ラセマーゼをコードするmurIの遺伝子産物の酵素科学的性質が明らかとなった(Table 8)。

5. まとめ

 ヒトが生命を維持していく為には、食品を摂取し食品から栄養素を体内に吸収し利用する必要がある。ヒトが持続的に食品を摂取するには、やはりその食品の味が大きな食品選択の要素となる。本研究でD-アミノ酸にはL-アミノ酸にはない食品の味を向上させる特異な機能があることが明らかとなった。冒頭にも述べたように、D-及びL-アミノ酸のうちなぜL−アミノ酸のみが生命の根幹を担う生体分子である酵素の構成要素となったのかは未だに解明されてはいないが、L-アミノ酸のみならずD-アミノ酸がL-アミノ酸にはない食品中での特異な呈味性という機能によってヒトの生命維持に直接あるいは間接的に関わる重要な機能を持つことは非常に興味深い。現在筆者は、さまざまな生酛由来乳酸菌株からD-アミノ酸生成能が高い菌株を選抜し、これらの乳酸菌株を乳酸菌添加生酛仕込みで用い、製品中のD-アミノ酸濃度を高めることにより味や総合評価のより優れた日本酒の生産を行うための試験醸造を行っている。また、D-アミノ酸生成能が高い生酛由来乳酸菌は、日本酒以外の食品製造にも応用でき、これらの乳酸菌を用いるD-アミノ酸強化食品の開発も行っている。さらに、D L-アラニン(食品添加物グレード)は日本国内で入手が容易であり、また厚生労働省により食品添加物として認可されていることなどから、D L-アラニンを旨味や甘味を増強する調味料として用いた新たな食品の開発も行っていきたいと考えている。われわれが確立した日本酒中のD-及びL-アミノ酸の定量法は、日本酒以外の食品中のD-及びL-アミノ酸の定量分析にも応用可能であり、発酵食品を中心としたさまざまな食品中のD-及びL-アミノ酸の分析を行い、新たなD-アミノ酸高含有食品の探索もさらに行っていきたいと考えている。今後D-アミノ酸によって機能が向上した食品が次々に開発、上市され、ヒトの生命維持に貢献していくことが期待される。

謝辞

 本研究は、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構イノベーション創出基礎的研究推進事業(平成20年度〜平成24年度)、菊正宗酒造株式会社との共同研究(平成21年度〜平成25年度)、私立大学戦略的研究基盤形成支援事業(平成25年度)により実施したものである。

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